Google překlad:
Vyhodnocení přírodních a rostlinných léčivých přípravků na aktivitu proti rostoucí a nerostoucí formě B. burgdorferi
Jie Feng 1 † , Jacob Leone 2 , Sunjya Schweig 3 * a Ying Zhang 1 *
- 1 Oddělení molekulární mikrobiologie a imunologie, Bloomberg School of Public Health, Johns Hopkins University, Baltimore, MD, USA
- 2 FOCUS Health Group, Naturopathic, Novato, CA, Spojené státy
- 3 California Center for Functional Medicine, Kensington, CA, Spojené státy
Lymská borelióza je nejčastější chorobou přenášenou vektory v USA a Evropě. Přestože současná doporučená léčba lymskou boreliózou je u většiny pacientů s boreliózou účinná, přibližně 10–20% pacientů nadále trpí přetrvávajícími příznaky. Existují různé anekdotické zprávy o použití bylinných extraktů k léčbě pacientů s přetrvávajícími příznaky s různým stupněm zlepšení. Není však jasné, zda je účinek bylinných produktů způsoben jejich přímou antimikrobiální aktivitou nebo jejich účinkem na imunitní systém hostitele. V této studii jsme zkoumali antimikrobiální účinky 12 běžně používaných rostlinných léčiv a tří dalších přírodních antimikrobiálních látek pro potenciální proti Borrelia burgdorferi aktivitu in vitro . Mezi nimi bylo zjištěno, že 7 extraktů přírodních produktů s 1% má dobrou aktivitu proti stacionární fázi B. burgdorferi kultury ve srovnání s kontrolními antibiotiky doxycyklinem a cefuroximem. Tyto aktivní rostliny zahrnují Cryptolepis sanguinolenta, Juglans nigra (černý ořech), Polygonum cuspidatum (japonská křídlatka), Artemisia annua (palina pelyňková), Uncaria tomentosa (kočičí dráp), Cistus incanus a Scutellaria baicalensis (čínská lebka). Naproti tomu Stevia rebaudiana, Andrographis paniculata , extrakt z grapefruitových semen, koloidní stříbro, monolaurin a antimikrobiální peptid LL37 měly malou nebo žádnou aktivitu proti stacionární fázi B. burgdorferi . Hodnoty minimální inhibiční koncentrace (MIC) Artemisia annua, Juglans nigra a Uncaria tomentosa byly pro pěstování poměrně vysoké B. burgdorferi , a to navzdory jejich silné aktivitě proti nerostoucí stacionární fázi B. burgdorferi . Na druhé straně, dvě nejvyšší aktivní byliny, Cryptolepis sanguinolenta a Polygonum cuspidatum , vykazovaly silnou aktivitu jak proti rostoucímu B. burgdorferi (MIC = 0,03–0,06%, respektive 0,25–0,5%), tak proti nepěstující stacionární fázi B. burgdorferi . Ve studiích subkultury pouze 1% Cryptolepis sanguinolenta způsobil úplnou eradikaci extraktu , zatímco doxycyklin a cefuroxim a další aktivní byliny nemohly vymýtit B. burgdorferi, buňky stacionární fáze protože po 21denní subkultuře bylo viditelné mnoho spirochet. Jsou zapotřebí další studie k identifikaci aktivních složek účinných rostlin a vyhodnocení jejich kombinací pro účinnější eradikaci B. burgdorferi in vitro a in vivo . Jsou diskutovány důsledky těchto zjištění pro zlepšení léčby perzistentní boreliózy.
Úvod
Lymská borelióza způsobená Borrelia burgdorferi a mnoha blízce příbuznými Borrelia druhy je nejčastější chorobou přenášenou lidmi na severní polokouli ( 1 , 2 ). Ve Spojených státech je ročně diagnostikováno přibližně 300 000 nových případů ( 3 , 4 ). Infekce přenášené klíšťaty jsou na vzestupu v USA a Evropě kvůli řadě různých faktorů, včetně změny klimatu ( 5 , 6 ) a narušení hustoty predátorů v příměstských oblastech ( 7 ). Nedávné studie o prevalenci klíšťat a zatížení patogenů identifikovaly nové zeměpisné oblasti, kde jsou přítomna vektorová klíšťata ( 8 ), a také nové patogeny přenášené klíšťaty přítomné v oblastech, kde dříve nebyly identifikovány (např. B. miyamotoi v severní Kalifornii) ( 9 ).
Lyme nemoc může ovlivnit mnoho různých tělesných systémů a orgánů ( 10 ). Zatímco mnoho pacientů se včasnou léčbou antibiotiky plně uzdraví, nejméně u 10–20% pacientů dochází k přetrvávajícím příznakům po konvenčně doporučeném cyklu 2–4 týdnů užívání antibiotik ( 11 , 12 ) a nedávná retrospektivní analýza dokumentovala 63% pacientů přetrvávající příznaky po léčbě antibiotiky pro lymskou boreliózu ( 13 ). Pacienti, kteří mají trvalé příznaky, mohou mít významné a trvalé zdravotní postižení ( 11 , 14 ) a zvýšené náklady na zdravotní péči a její využití ( 13 ). B. burgdorferi se může vyhnout reakci imunitního systému ( 15 , 16 ) a četné studie ukázaly, že bakterie jsou schopny přetrvávat v různých tkáních na různých zvířecích modelech i přes agresivní a dlouhodobou antibiotickou terapii ( 17 – 19 ).
Kromě výše zmíněných studií na savcích B. burgdorferi byla ve studiích na lidech a kazuistikách prokázána perzistence po léčbě antibiotiky ( 20 – 23 ). Trvalé příznaky lymské boreliózy významně ovlivňují kvalitu života ( 24 , 25 ), proto někteří lékaři léčí tyto pacienty dlouhodobými antibiotiky. Tento přístup je však kontroverzní s jedním pokynem lékařské společnosti ( 26 ), který se zasazuje proti ustupujícím pacientům s přetrvávajícími (> 6 měsíců) příznaky, a dalším pokynem lékařské společnosti ( 27 ) doporučujícím individuální posouzení rizik a přínosů a potenciální opakovanou léčbu nebo dlouhodobější léčbu pacientů přetrvávající příznaky. Zatímco byla spojena se zlepšenými klinickými výsledky ( 27 , 28 léčba antibiotiky ), zdá se, že léčba antibiotiky je účinnější proti aktivně se dělící formě spirochet. Kromě toho bylo prokázáno, že B. burgdorferi může měnit morfologii a vytvářet mikrokolonie podobné biofilmu skládající se z bakterií přetrvávajících ve stacionární fázi ( 29 – 31 ). Tradiční antibiotika mají nízkou aktivitu proti atypickým perzistujícím formám (kulatá těla, mikrokolonie a biofilm) a dříve jsme pracovali na identifikaci nových léků a kombinací léků, které jsou účinné proti těmto atypickým formám ( 29 , 30 , 32 ). Zatímco Daptomycin a dapson byly identifikovány jako mající významný účinek proti Borrelia persister buněk in vitro ( 29 , 33 ), a in vivo v modelu myší ( 31 ), jejich použití v klinické praxi může být omezeno vedlejšími účinky (oba), náklady ( daptomycin), parenterální podání (daptomycin) a špatná penetrace do CNS (daptomycin) ( 34 ). Vzhledem k omezením současné léčby Lyme je životně důležité, aby byly pro klinické použití identifikovány nové, bezpečné a účinné terapie.
Důležité je, že bylo prokázáno, že botanická léčiva mají in vitro antimikrobiální aktivitu proti různým morfologickým formám B. burgdorferi . Protože existuje omezený počet studií hodnotících účinky botanické medicíny na B. burgdorferi , je užitečné čerpat z klinických studií, které prokázaly přínos použití botanických léků pro jiné spirochetální infekce a infekce, jako je mycobacterium, o nichž je známo, že vytvářejí přetrvávající antibiotika buňky ( 35 ). Například se , že ukázalo Andrographis účinně léčí leptospirózu v čínských klinických studiích ( 36 ) a zlepšuje klinické výsledky v kombinaci se standardní léčbou tuberkulózy ( 37 ).
Botanická medicína má dlouhou historii používání, začíná téměř před 5 000 lety v Mezopotámii a v Číně má dokumentované použití přes 3 000 let ( 38 ). Bezpečnost rostlinných léčivých přípravků byla po staletí dokumentována v různých tradičních systémech medicíny, jako je ajurvédská medicína a tradiční čínská medicína. Nedávné retrospektivní a systematické recenze v Evropské unii a Jižní Americe dospěly k závěru, že závažné nežádoucí účinky spojené s užíváním botanické medicíny byly vzácné ( 39 , 40 ).
Tato studie navazuje na předchozí studie, které využívaly náš in vitro model perzistence stacionární fáze a test SYBR Green I / propidium jodid (PI) k screeningu potenciálních antimikrobiálních kandidátů. Po předchozí identifikaci nových léků a kombinací léků z knihovny léků FDA ( 32 ), jakož i vybraných rostlinných látek ve formě éterického oleje, které mají proti B. burgdorferi aktivitu ( 41 , 42 ), v této studii (Feng et al. Https : //www.biorxiv.org/content/10.1101/652057v1.full ) jsme zkoumali účinek 12 botanických léčiv a 3 dalších přírodních antimikrobiálních látek na potenciální proti B. burgdorferi aktivitu in vitro .
Materiály a metody
Kmenové, mediální a kulturní techniky
B. burgdorferi Kmen B31 byl kultivován v médiu BSK-H (HiMedia Laboratories Pvt. Ltd.) s 6% králičím sérem (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Celé kultivační médium bylo filtračně sterilizováno 0,2 μm filtrem. Kultury byly inkubovány do sterilní 50 ml kónické trubky (BD Biosciences, CA, USA) v mikroaerofilní inkubátoru (33 ° C, 5% CO 2 ) bez antibiotik.
Botanical and Natural Medicines
Skupina přírodních výtažků: Polygonum cuspidatum, Cryptolepis sanguinolenta, Artemisia annua, Juglans nigra, Uncaria tomentosa, Scutellaria baicalensis, Stevia rebaudiana, Cistus incanus, Andrographis paniculata, Ashwagandha somnifera, Dipsacus fullo, Dipsacus fullo stříbro a příslušné kontroly rozpouštědla (viz tabulka 1 byly identifikovány ). Botanická léčiva nebo přírodní produkty byly vybrány na základě anekdotického klinického použití a preklinických údajů z literatury. Primární kritéria pro výběr sloučenin pro předkládanou studii zahrnovala látky, které v předchozích studiích vykazovaly významné účinky proti boreliím, mají příznivé bezpečnostní profily a mohou být absorbovány systémově. Další kritéria pro výběr sloučenin zahrnovala anekdotické zprávy od pacientů a / nebo poskytovatelů, účinky proti biofilmu a schopnost překročit hematoencefalickou bariéru.
STŮL 1
Tabulka 1 . Zdroje botanické a přírodní medicíny, validace a testování.
Botanická léčiva pocházela z KW Botanicals (San Anselmo, Kalifornie) a Heron Botanicals (Kingston, Washington). Rostliny byly identifikovány makroskopickými a organoleptickými metodami a vzorky poukazů jsou uloženy v příslušných výrobních zařízeních. Většina rostlinných léčivých přípravků byla dodávána jako alkoholové extrakty s obsahem alkoholu 30, 60 a 90% a použitý alkohol byl také testován samostatně jako kontrola v různých ředěních. Monolaurin (značka Lauricidin ™) (rozpuštěný ve 100% DMSO) a koloidní stříbro (značka Argentyn ™) byly zakoupeny komerčně. LL37 a kontrola byla získána od Taylor Made Pharmacy v Nicholasville, KY. Produkty Citrosept ™ (Cintamani, Polsko) a Nutribiotic ™ extrakt z grapefruitových semen a kontrola byly komerčně zakoupeny. V tabulce 1 najdete další podrobnosti o získávání, testování a validaci použitých botanických a přírodních léčiv.
Doxycyklin (Dox) a cefuroxim (CefU) (Sigma-Aldrich, USA) byly rozpuštěny ve vhodných rozpouštědlech ( 43 ) za vzniku zásobních roztoků 5 mg / ml. Zásoby antibiotik byly filtračně sterilizovány 0,2 μm filtrem a skladovány při -20 ° C.
Mikroskopie
B. burgdorferi Spirochety a agregované mikrokolonie ošetřené přírodními produkty nebo kontrolními léky byly obarveny SYBR Green I a PI (propidium jodid) a zkontrolovány fluorescenčním mikroskopem BZ-X710 All-in-One (KEYENCE, Itasca, IL, USA). Životaschopnost bakterií byla provedena výpočtem poměru zelené / červené fluorescence k určení poměru živých a mrtvých buněk, jak bylo popsáno výše ( 29 ). Čtení životaschopnosti zbytkových buněk bylo získáno analýzou tří reprezentativních obrazů stejné suspenze bakteriálních buněk pořízených fluorescenční mikroskopií. Ke kvantitativnímu stanovení životaschopnosti bakterií z obrazů mikroskopů byl použit software Image Pro-Plus k vyhodnocení intenzity fluorescence, jak bylo popsáno výše ( 30 ).
Hodnocení přírodních produktů pro jejich aktivitu proti B. burgdorferi kulturám stacionární fáze
B. burgdorferi B31 byl kultivován po dobu 7 dnů v mikroaerofilní inkubátoru (33 ° C, 5% CO 2 ) jako stacionární fáze kultury (~ 10 7-8 spirochet / ml). Aby se vyhodnotila potenciální antiperzistentní aktivita přírodních produktů, přidaly se jejich zásoby a jejich kontrolní rozpouštědla do 100 ul B. burgdorferi kultury stacionární fáze na 96jamkových destičkách, aby se získaly požadované koncentrace. Botanická léčiva a extrakty přírodních produktů byly testovány s koncentrací 1, 0,5 a 0,25% (v / v); jako kontroly byla použita antibiotika daptomycin, doxycyklin a cefuroxim v konečné koncentraci 5 μg / ml. Všechny výše uvedené testy byly prováděny v trojím provedení. Mikrotitrační destičky byly uzavřeny a inkubovány při teplotě 33 ° C bez třepání po dobu 7 dnů s 5% CO 2 .
Subkulturní studie k potvrzení aktivity nejlepších přírodních produktů
Pro subkulturní studii byl 1 ml B. burgdorferi kultury stacionární fáze ošetřen přírodními produkty nebo kontrolními léky v 1,5 ml zkumavkách Eppendorf po dobu 7 dnů při 33 ° C bez třepání. Poté byly buňky centrifugovány a buněčné pelety byly promyty čerstvým médiem BSK-H (1 ml) a poté resuspendovány v čerstvém médiu BSK-H bez antibiotik. Pak se 50 ul buněčné suspenze se naočkuje do 1 ml čerstvého BSK-H médium pro subkultury při teplotě 33 ° C, 5% CO 2 . Růst buněk byl monitorován pomocí testu SYBR Green I / PI a fluorescenční mikroskopie po 7–20 dnech.
Výsledek
Hodnocení aktivity extraktů přírodních produktů proti stacionární fázi B. burgdorferi
Testovali jsme panel rostlinných léčiv a extraktů přírodních produktů a jejich odpovídající kontroly proti 7denní B. burgdorferi stacionární kultuře na 96jamkových destičkách inkubovaných po dobu 7 dnů. Tabulka 2 shrnuje aktivitu těchto extraktů přírodních produktů proti stacionární fázi koncentraci B. burgdorferi kultury v 1, 0,5 a 0,25%. Mezi nimi bylo zjištěno, že 7 extraktů přírodních produktů s 1% má silnou aktivitu proti stacionární fázi B. burgdorferi kultury ve srovnání s kontrolními antibiotiky doxycyklinem a cefuroximem ( tabulka 2 ). Abychom eliminovali autofluorescenční pozadí, zkontrolovali jsme poměr reziduálních živých buněk a mrtvých buněk zkoumáním mikroskopických snímků, jak bylo popsáno výše ( 30 ). Pomocí fluorescenční mikroskopie jsme potvrdili, že 1% Cryptolepis sanguinolenta, Juglans nigra a Polygonum cuspidatum mohou vymýtit téměř všechny živé buňky, přičemž zbývají pouze mrtvé a agregované buňky, jak je znázorněno na obrázku 1 . Při 0,5% koncentraci 11 přírodních produktových extraktů ( Polygonum cuspidatum 60% EE, Cryptolepis sanguinolenta 60% EE, Artemisia annua 90% EE, Juglans nigra 30–60% EE, Uncaria tomentosa WE, Artemisia annua 60% EE, Polygonum cuspidatum 90% EE, Scutellaria baicalensis ) stále vykazovaly silnější aktivitu než současný klinicky používaný doxycyklin a cefuroxim ( tabulka 2 a obrázek 1 ). Mezi nejaktivnějšími výtažky z přírodních produktů patřily Cryptolepis sanguinolenta 60% EE, Polygonum cuspidatum 60% EE, Artemisia annua 90% EE, Juglans nigra 60% EE, Uncaria tomentosa WE, Artemisia annua 60% EE, a to díky jejich vynikající činnosti dokonce na 0,25%, jak ukazuje lepší aktivita než kontrolní léky ( tabulka 2 a obrázek 1 ). Zejména 0,25% Cryptolepis sanguinolenta by mohlo eradikovat nebo rozpustit všechny B. burgdorferi buňky včetně agregovaných forem, protože jsme při pozorování mikroskopem SYBR Green I / PI našli vzácné živé nebo dokonce mrtvé buňky ( obrázek 1 ). Ačkoli Juglans nigra dokázal vymýtit téměř všechny stacionární fáze B. burgdorferi buňky na 0,5% ( obrázek 1 ), nemohl zabít agregovanou formu mikrokolonie na 0,25%, jak ukazuje mnoho živých (zelených) mikrokolonií pomocí mikroskopie SYBR Green I / PI. Ačkoli údaje čtečky destiček ukázaly, že Polygonum cuspidatum 60% ethanolický extrakt měl nejsilnější aktivitu při 0,25%, výsledek mikroskopu to nepotvrdil kvůli vyšší zbytkové životaschopnosti než u Cryptolepis sanguinolenta a Juglans nigra ( obrázek 1 ).
TABULKA 2
Tabulka 2 . Aktivita přírodních produktů proti pěstování (MIC) a stacionární fázi B. burgdorferi .
OBRÁZEK 1
Obrázek 1 . Vliv přírodních extraktů na životaschopnost stacionární fáze B. burgdorferi . Sedmidenní stará B. burgdorferi kultura stacionární fáze byla ošetřena extrakty přírodního produktu v koncentraci 1, 0,5 a 0,2% po dobu 7 dnů, následovalo barvení pomocí testu životaschopnosti SYBR Green I / PI a fluorescenční mikroskopie.
Testovali jsme také několik dalších bylin a látek, které používají Lyme pacienti, včetně Stevia rebaudiana, Andrographis paniculata , extraktu z grapefruitových semen, Ashwagandha somnifera , koloidního stříbra, Lauricidinu a antimikrobiálního peptidu LL-37, ale zjistili jsme, že mají malou nebo žádnou aktivitu proti stacionární fáze B. burgdorferi buňky.
Hodnoty MIC aktivních přírodních výtažků
Protože aktivita antibiotik proti nerostoucímu B. burgdorferi není vždy korelována s jejich aktivitou proti rostoucím bakteriím ( 30 ), stanovili jsme proto MIC těchto extraktů přírodních produktů proti replikujícím se B. burgdorferi, jak bylo popsáno výše ( 32 ). Hodnoty MIC některých extraktů přírodních produktů, jako jsou Artemisia annua, Juglans nigra, Uncaria tomentosa, byly pro pěstování poměrně vysoké B. burgdorferi , a to navzdory jejich silné aktivitě proti nerostoucí stacionární fázi B. burgdorferi buněk ( tabulka 2 ). Na druhé straně dva nejvýznamnější extrakty aktivních přírodních produktů Cryptolepis sanguinolenta a Polygonum cuspidatum vykazovaly silnou aktivitu proti rostoucímu B. burgdorferi s nízkým MIC (0,03–0,06%, respektive 0,25–0,5%) a také nerostoucí stacionární fází B . burgdorferi ( tabulka 2 ).
Subkulturní studie k hodnocení aktivity extraktů přírodních produktů proti stacionární fázi B. burgdorferi
Abychom potvrdili aktivitu extraktů přírodních produktů při eradikaci stacionární fáze B. burgdorferi buněk , provedli jsme subkulturní studie, jak bylo popsáno výše ( 30 ). Dále jsme testovali nejvyšší aktivní extrakty přírodních produktů ( Cryptolepis sanguinolenta, Polygonum cuspidatum, Artemisia annua, Juglans nigra a Scutellaria baicalensis ), abychom zjistili, zda mohou eradikovat stacionární fázi B. burgdorferi po ošetření buněk na 1 nebo 0,5% ( tabulka 2 ). Ošetření 1% Cryptolepis sanguinolenta extraktem nezpůsobilo v subkulturní studii žádný opětovný růst ( tabulka 2 a obrázek 2 ). Jiné extrakty přírodních produktů, včetně Polygonum cuspidatum, Artemisia annua, Juglans nigra a Uncaria tomentosa, však nemohly vymýtit B. burgdorferi, buňky stacionární fáze protože po 21denní subkultuře bylo stále viditelné mnoho spirochet ( tabulka 2 a obrázek 2 ). Při 0,5% všechny vzorky ošetřené extrakty přírodního produktu dorostly zpět po 21denní subkultuře ( tabulka 2 a obrázek 2 ), avšak pouze jeden ze tří Cryptolepis sanguinolenta dorostl vzorků ošetřených extraktem zpět. To naznačuje, že 0,5% Cryptolepis sanguinolenta extrakt má stále silnou aktivitu a může téměř vymýtit stacionární fázi B. burgdorferi buněk . Naproti tomu klinicky používaná antibiotika doxycyklin a cefuroxim v klinicky relevantní koncentraci (5 μg / ml) nemohly sterilizovat B. burgdorferi kulturu stacionární fáze , protože spirochety byly viditelné po 21denní subkultuře ( tabulka 2 ).
OBRÁZEK 2
Obrázek 2 . Subkultura Borrelia burgdorferi po ošetření výtažky z přírodních produktů. Sedmidenní stacionární fáze B. B. burgdorferi kultura byla ošetřena uvedenými extrakty přírodního produktu po dobu 7 dnů, načež následovalo promytí a resuspendování v čerstvém médiu BSK-H a subkultura po dobu 21 dnů. Životaschopnost subkultury byla zkoumána barvením SYBR Green I / PI a fluorescenční mikroskopií.
Diskuse
V této studii jsme hodnotili skupinu botanických léčivých přípravků a přírodních produktů běžně používaných některými pacienty ke zvládnutí jejich přetrvávajících příznaků lymské boreliózy a zjistili jsme, že některé z nich skutečně mají silnou aktivitu proti B. burgdorferi . Patří mezi ně Cryptolepis sanguinolenta, Polygonum cuspidatum, Juglans nigra, Artemisia annua, Uncaria tomentosa, Cistus incanus a Scutellaria baicalensis . Antimikrobiální aktivity těchto 7 aktivních bylin jsou uvedeny v doplňkové tabulce 1 . Tato zjištění mohou poskytnout základ pro klinické zlepšení pacientů, kteří užívají tyto léky, a také nepřímo naznačují, že jejich přetrvávající příznaky mohou být způsobeny přetrvávajícími bakteriemi, které nejsou usmrceny konvenční léčbou Lyme antibiotiky. Překvapivě Andrographis paniculata, Stevia rebaudiana ( 44 ), Koloidní stříbro (Argentyn 23 ™), Monolaurin (Lauricidin ™), Dipsacus spp. A Withania somnifera , u nichž se předpokládá nebo dříve uvádí, že mají aktivitu proti borrelii, nevykazovaly významné aktivita proti stacionární fázi nebo růstu B. burgdorferi v této studii.
Cryptolepis sanguinolenta je rostlina pocházející z Afriky, kde se v tradiční medicíně používá k léčbě malárie, tuberkulózy, hepatitidy a septikémie ( 45 ). Cryptolepis sanguinolenta V předklinických studiích bylo prokázáno, že má protizánětlivé ( 46 , 47 ) antibakteriální ( 48 – 50 ), fungicidní ( 51 ), anti-amébové ( 52 ) a antimalarické ( 53 , 54 ) vlastnosti. Dvě předběžné klinické studie dokumentovaly významnou účinnost při léčbě nekomplikované malárie bez známek zjevné toxicity ( 55 ). Zatímco bylo identifikováno několik sekundárních metabolitů s antimikrobiální aktivitou, dosud nejlépe studovaný byl alkaloid zvaný kryptolepin. Antimikrobiální aktivita kryptolepinu je považována za sekundární vůči mnoha mechanismům účinku, včetně baktericidních a bakteriostatických účinků ( 48 ). Přesněji řečeno, bylo prokázáno, že kryptolepin způsobuje morfologické změny a buněčný rozpad ( 51 ), stejně jako účinky interkalace DNA a inhibice topoizomerázy II ( 56 , 57 ). Je třeba poznamenat, že kromě kryptolepinu další složky v Cryptolepis sanguinolenta bylo prokázáno, že mají antimikrobiální aktivitu také ( 58 ).
Cryptolepis sanguinolenta je obecně dobře snášen a během jeho relativně dlouhodobého užívání v částech Číny a Indie bylo u lidí zdokumentováno několik vedlejších účinků. Studie na potkanech naznačují, že dávky extraktu až do 500 mg / kg jsou relativně bezpečné ( 59 ). Důležitým novým poznatkem této současné studie je skutečnost, že Cryptolepis sanguinolenta má silnou aktivitu proti pěstování B. burgdorferi s nízkým MIC a také proti nepěstování stacionární fáze B. burgdorferi ( tabulka 2 a obrázky 1 , 2 ). Vzhledem k jeho tradičnímu použití proti malárii se v léčebné komunitě pro Lyme Cryptolepis sanguinolenta používá k léčbě Babesia spp. ( 60 ), což může být společně infikující organismus podobný malárii. Pokud je nám známo, protiboreliální účinek Cryptolepis sanguinolenta nebyl dosud zdokumentován a další vitro a in in vivo za jsou vyžadovány studie účelem zkoumání potenciální role, kterou Cryptolepis sanguinolenta hrát může při léčbě lymské boreliózy.
juglans nigra Bylo prokázáno, že a jeho složky mají antioxidační, antibakteriální, protinádorové a chemoprotektivní účinky ( 61 , 62 ). Předchozí in vitro testování dokumentovalo, že Juglans nigra vykazoval bakteriostatickou aktivitu proti logaritmickým spirochetám B. burgdorferi a B. garinii a baktericidní aktivitu proti Borrelia kulatým tělům ( 63 ). dvě různé komerčně dostupné botanické formulace, které obsahují Juglans nigra, Nedávno bylo rovněž prokázáno, že mají aktivitu proti spirochetám fáze kmene B. burgdorferi logické kmene GCB726, kulatým tělům a tvorbě biofilmu při in vitro testování ( 64 ). Juglans nigra Bylo také prokázáno, že má více složek ( 65 ) s antimikrobiálními vlastnostmi, včetně juglonu (5-hydroxy-1,4-naftalendionu), fenolových kyselin, flavonoidů a katechinů (včetně epigalokatechin galátu) ( 66 , 67 ). Jsou zapotřebí další studie k objasnění, které složky mají anti-boreliální aktivitu. Juglans nigra je dobře snášen a nežádoucí účinky jsou neobvyklé. U některých jedinců může způsobit gastrointestinální poruchy ( 68 ) a vyvolat změny v pigmentaci kůže ( 69 , 70 ). Může se vyskytnout určitá alergická zkřížená reaktivita u osob alergických na ořechy nebo ořechy, stejně jako případy dermatitidy hlášené u lidí ( 71 ). Bylo zjištěno, že juglon účinné látky má orální LD50 u potkanů 112 mg / kg ( 72 ).
Polygonum cuspidatum dokumentuje protinádorové, antimikrobiální, protizánětlivé, neuroprotektivní a kardioprotektivní účinky ( 73 , 74 ), přičemž jednou z hlavních aktivních složek je polyfenol resveratrol. Předchozí in vitro testování dokumentovalo, že resveratrol vykazoval aktivitu proti spirochetám logreální fáze Borrelia burgdorferi a Borrelia garinii , minimální aktivitu proti kulatým tělům borrelie a žádnou významnou aktivitu proti biofilmům spojeným s boreliemi ( 63 ). Další aktivní složka, emodin (6-methyl-1,3,8-trihydroxyanthrachinon), dokumentuje aktivitu proti stacionární fázi B. burgdorferi buňky ( 75 ). Předklinický výzkum navíc dokumentoval další antibakteriální a anti-biofilmové účinky ( 76 , 77 ). Antibakteriální aktivita P. cuspidatum byla přičítána jeho stilbenům (včetně resveratrolu) a obsahu hydroxyanthrachinonu ( 78 ). Ve lidech Polygonum cuspidatum studiích na zvířatech a bylo zjištěno, že má minimální toxicitu. Mohou nastat gastrointestinální potíže a průjem, ale vyřeší se snížením nebo zastavením příjmu ( 79 ). I když u lidí bylo provedeno několik studií, v přehledu z roku 2010 se zjistilo, že je dobře absorbován a rychle metabolizován.
Artemisia annua (pelyněk pravý také nazývaný pelyněk čínský a Qing Hao) je léčivá rostlina, která se používá k léčebným účelům již více než 2000 let ( 80 ), a izolaci aktivní složky zvané artemisinin získala v roce 2015 Nobelovu cenu při léčbě malárie ( 81 ). Artemisinin má také předchozí dokumentovanou aktivitu proti stacionární fázi B. burgdorferi přetrvává v in vitro modelech ( 32 , 82 ). Malá pilotní studie dále prokázala, že syntetický analog k artemisininu, nazývaný artesunát, ukázal významné snížení krátkodobé poruchy paměti u pacientů s lymskou boreliózou v kombinaci s intravenózním ceftriaxonem ( 83 ). Antimikrobiální mechanismus účinku artemisininu není zcela objasněn ( 84 ), ale předpokládá se, že souvisí s jeho schopností generovat volné radikály, které poškozují proteiny ( 85 , 86 ). Obsah artemisininu ve Artemisia annua vzorku použitém v této studii byl potvrzen na 0,11% pomocí vysoce účinné kapalinové chromatografie / UV-vizuální spektroskopie v Ústavu pro bezpečnost a obranu potravin (Centralia, WA). Vysoce kvalitní Artemisia annua by měla obecně obsahovat> 0,3% artemisininu. Navzdory potenciálním suboptimálním hladinám artemisininu přítomného v Artemisia annua použitém pro tuto studii vykazovaly 60 i 90% alkoholové extrakty Artemisia annua lepší aktivitu proti stacionární fázi B. burgdorferi ve srovnání s kontrolními antibiotiky cefuroximem a doxycyklinem. Jedním vysvětlením těchto výsledků by mohlo být, že jiné složky než artemisinin jsou důležité při zajišťování antimikrobiálních účinků, což je nález podporovaný předchozími studiemi ( 59 , 87 ). Artemisia annua je obecně považována za bezpečnou za předpokladu, že podávaný přípravek obsahuje minimální nebo žádný thujon a jiné deriváty terpenů, které jsou potenciálně neurotoxické ( 88 ). Studie na potkanech zjistily, že NOAEL (úroveň bez pozorovaných nepříznivých účinků) z Artemisia annua extraktu byla odhadnuta na ekvivalent 1,27 g / kg / den u mužů a 2,06 g / kg / den u žen) nebo více ( 89 ) . U lidí se Artemisia annua bezpečně užívá v dávkách až 2250 mg denně po dobu až 10 týdnů ( 88 ) a 1800 mg denně se také bezpečně používá po dobu až 6 měsíců ( 88 ). Při vyšších dávkách se mohou objevit gastrointestinální potíže včetně mírné nevolnosti, zvracení (vzácnější) a bolesti břicha ( 60 ). Použití extraktů z celé rostliny namísto jednotlivých složek nabízí potenciální výhody, včetně zajištění více mechanismů působení a synergických účinků, které mohou snížit riziko vzniku mikrobiální rezistence. Objevující se příklad toho lze spatřit v léčbě malárie, kde byla hlášena významná rezistence u kombinované terapie založené na artemisininu (ACT) ( 90 , 91 ), zatímco předběžné studie ukazují zlepšenou účinnost a snížené vedlejší účinky při léčbě celou Artemisia rostlinou se používá ( 87 , 92 ).
Scutellaria baicalensis Bylo prokázáno, že a jeho složky mají neuroprotektivní, antioxidační, antiapoptotickou, protizánětlivou a anti-excitotoxickou aktivitu ( 93 – 96 ). Bylo zjištěno, že jedna z aktivních složek nalezených ve Scutellaria baicalensis , baicalein, vykazuje logické in vitro aktivitu proti různým morfologickým formám B. burgdorferi a B. garinii , včetně spirochet fáze, latentních kulatých těl a formací biofilmu ( 97 ). Další výzkum dále dokumentoval antimikrobiální aktivitu ( 98 ), synergické účinky s antibiotiky ( 99 – 101 ) a sníženou tvorbu biofilmu ( 102 ). Scutellaria baicalensis dokumentovala klinickou bezpečnost ( 103 , 104 ). Existují zprávy o sedaci a bylo prokázáno, že je aktivní na receptorových místech GABA ( 105 , 106 ). Kombinace lékařské stravy s čištěnou Scutellaria baicalensis a kůrou z Acacia catechu obsahující koncentrovaný baicalin a katechin (Limbrel ™, Move Free Advanced ™) způsobila reverzibilní poškození jater v nejméně 35 případech s odhadovaným odhadovaným výskytem přibližně 1 z 10 000 ( 107 ). Navzdory kazuistikám o hepatotoxicitě byla pro tento komerční produkt identifikována dávka 1 000 mg / kg denně jako hladina bez pozorovaných nepříznivých účinků (NOAEL) ( 108 ). Hepatotoxicita není obecně pozorována z extraktu celé rostliny a v nedávné studii nebyla zjištěna žádná hepatotoxicita u pacientů užívajících 1 335 mg denně v průměru po 444 dní ( 109 ).
Uncaria tomentosa dokumentoval neuroprotektivní účinky v předklinických studiích ( 110 ) a předběžné studie u lidí ukázaly zlepšenou kvalitu života u jedinců s rakovinou ( 111 ), zlepšenou opravu DNA ( 112 ) a zlepšení symptomů u jedinců s revmatoidní artritidou ( 113 ) a osteoartróza ( 114 ). Potenciální antimikrobiální účinky Uncaria tomentosa nebyly široce hodnoceny. V publikaci, která recenzována, , že Uncaria tomentosa nebyla bylo hlášeno má anti-boreliální účinky v in vitro modelu ( 115 ). Uncaria tomentosa byla také prokázána v recenzovaném výzkumu, že má antimikrobiální účinky proti lidským orálním patogenům ( 116 ). Uncaria tomentosa Bylo zjištěno, že je bezpečná a má minimální vedlejší účinky v různých studiích na zvířatech a lidech ( 112 ). Studie na lidech v rozmezí od 4 týdnů ( 114 ) do 52 týdnů ( 113 ) prokázaly nežádoucí účinky srovnatelné s placebem. I když byly hlášeny gastrointestinální potíže, jako je nevolnost, průjem, bolesti břicha a anémie, mělo se za to, že studovaní pacienti měli zdravotní potíže z progrese solidních nádorových onemocnění a ne nutně z Uncaria ( 111 ). Akutní střední smrtelná dávka u myší byla> 16 g / kg tělesné hmotnosti ( 117 ).
Bylo navrženo, že Cistus incanus a Cistus creticus jsou synonyma ( www.theplantlist.org ), zatímco jiné zdroje naznačují, že Cistus creticus je poddruhem Cistus incanus ( 118 ). Předběžné klinické studie prokázaly významné zlepšení infekcí horních cest dýchacích a zánětlivých markerů u pacientů užívajících Cistus incanus ( 119 ), u těkavých olejových extraktů z Cistus creticus bylo prokázáno, že mají anti-boreliální účinky v in vitro modelu ( 120 ). Další in vitro studie dokumentovaly antimikrobiální účinky Cistus creticus proti několika bakteriím ( 118 , 121 ). Cistus creticus také prokázal významnou inhibici Streptococcus mutans tvorby biofilmu ( 121 ) a snížení bakteriální adherence ke sklovině ( 122 ). Cistus creticus Ukázalo se, že obsahuje několik aktivních složek ( 123 ), včetně karvakrolu ( 120 ). Vzhledem k tomu, že naše laboratoř dříve dokumentovala, že carvacrol má významnou aktivitu proti log a stacionární fázi B. burgdorferi buněk ( 41 ), je možné, že obsah carvacrolu ve Cistus incanus vzorku testovaném v této studii přispěl k významnému snížení log a stacionární fáze B. burgdorferi buňky v této studii. Cistus incanus Rostlinné extrakty z se po staletí používají v tradiční medicíně bez hlášení nežádoucích účinků nebo alergických reakcí ( 124 ). V randomizované placebem kontrolované studii se 160 pacienty bylo 220 mg denně Cistus incanus dobře tolerováno s menšími nežádoucími účinky než ve skupině s placebem ( 119 ). Zatímco farmakokinetické údaje o bezpečnosti jsou řídké, studie buněčných kultur ukázala, že Cistus incanus nezpůsobil žádné nepříznivé změny v buněčné proliferaci, přežití nebo funkci buněčných receptorů ( 124 ).
O extraktu z grapefruitových semen (GSE) se již dříve uvádí, že má in vitro aktivitu proti pohyblivým a cystickým morfologickým formám bakterií borrelia v in vitro modelu ( 125 ). Naopak současná studie neprokázala smysluplnou aktivitu proti B. burgdorferi . Existuje několik možných důvodů k vysvětlení rozdílu ve výsledcích mezi současnou studií a předchozí studií, včetně rozdílů ve formulacích GSE a / nebo různých druzích borélie používaných v kultuře. V současné studii jsme použili B. burgdorferi kmen B31, zatímco ve studii z roku 2007 se uvádí, že „ B. afzelii byl použit ACA-1“. Zatímco obě studie používaly značku GSE od Citrosept ™, formulace byla upravena a v současné době má označení „organické“. Vzhledem k tomu, že předchozí studie dokumentovaly několik kontaminujících látek v komerčních formulacích GSE, včetně benzalkoniumchloridu, triclosanu a methylparabenu ( 126 , 127 ), před zařazením do naší současné studie jsme prověřili přítomnost kontaminujících látek GSE. Bylo zjištěno, že vzorek Citrosept ™ nemá detekovatelné úrovně kontaminantů, a proto byl v současné studii použit jako zdroj GSE. Naproti tomu druhá komerčně dostupná značka GSE (Nutribiotic ™) měla pozitivní test na zvýšené hladiny benzalkoniumchloridu, což je známá antimikrobiální sloučenina ( 128 ), a podílí se na interakcích mezi léčivy a bylinami, které způsobují potenciální obavy o bezpečnost u pacientů užívajících GSE. ( 129 ). Studie z roku 2007 nezaznamenala testování na kontaminující látky, takže je možné, že předchozí formulace Citrosept ™ obsahovala kontaminující látku, která vykazovala anti-boreliální aktivitu.
Stevia rebaudiana Nedávno se uvádí, že má silnou aktivitu proti boreliím ( 44 ). V našem testování však Stevia rebaudiana neprokázala žádnou aktivitu proti B. burgdorferi . Jednou z možností, jak tuto nesrovnalost vysvětlit, je, že studie, která uváděla Stevia rebaudiana aktivitu proti B. burgdorferi, neměla odpovídající kontrolu nad alkoholem. Hypoteticky lze pozorovat dříve zdokumentovaný protiboreliální účinek, který mohl být způsoben nespecifickým účinkem alkoholu na Borrelia bakterie a nikoli Stevií rebaudiana samotnou , nebo rozdíly v druzích rostlin, podmínkách pěstování nebo způsobu zpracování byliny. . Jelikož jsme náš Stevia rebaudiana přípravek získali od zkušeného bylinkáře, který jej extrahoval pomocí známé koncentrace alkoholu, pracovali jsme s přípravkem se známou koncentrací alkoholu. Když jsme použili správnou kontrolu alkoholu, nezjistili jsme, že by Stevia rebaudiana měla jakoukoli aktivitu proti B. burgdorferi ( tabulka 2 ).
Andrographis paniculata se používá k léčbě spirochetální infekce leptospirózy ( 36 ) a anekdoticky se používá u pacientů s lymskou boreliózou ( 60 ). Zjistili jsme však, že Andrographis neprokázal žádnou aktivitu proti B. burgdorferi v našem testování . Je možné, že Andrographis nepřímo působí na imunitní systém hostitele, aby zabil B. burgdorferi, nebo vyvolává nespecifickou odpověď hostitele. K otestování možného účinku jsou zapotřebí další studie Andrographi na imunitní buňky hostitele .
I když tato současná studie identifikovala nová nová botanická a přírodní léčiva s in vitro anti- boreliovou aktivitou, je také pozoruhodné, že mnoho testovaných bylin nebo sloučenin nevykazovalo přímou anti- boreliovou aktivitu navzdory skutečnosti, že jsou široce používány, s neoficiálními zprávami klinické účinnosti ze strany pacientů a odborníků v komunitním prostředí ( https://www.lymedisease.org/mylymedata-alternative-lyme-disease-treatment/ ) ( 60 ). Je důležité vzít v úvahu potenciální omezení in vitro modelu vzhledem k tomu, že existuje mimo biologický organismus. Model in vitro může poskytnout informace o přímé antimikrobiální aktivitě, a přestože může být součástí funkce botanických a přírodních léčiv, může fungovat také prostřednictvím dalších různých cest. Například mohou projevovat účinky prostřednictvím protizánětlivé / anti-cytokinové aktivity, regulace / zesílení imunitního systému, adaptogenní stimulace buněčných a obranných systémů organismu a narušení biofilmu. Při těchto činnostech se mechanismy léčivých přípravků spoléhají na komplexní souhru a interakci mezi různými tělesnými systémy, ke kterým může docházet pouze v živém organismu. Protože in vitro model není schopen poskytnout informace o alternativních způsobech působení přírodních rostlinných léčivých přípravků, je důležité, aby budoucí in vivo byly prováděny studie za účelem zkoumání aktivity a účinnosti těchto a dalších botanických a přírodních léčivých přípravků proti borreliím a dalším nemoci přenášené klíšťaty. Tyto typy studií budou mít zásadní význam vzhledem k mnoha faktorům, které hrají současnou epidemii nemocí přenášených klíšťaty v naší společnosti i na celém světě. Zatímco výzkum začíná poskytovat informace o nových kombinacích antibiotik, které by mohly být účinné proti mnoha formám Borrelia bakterií ( 31 ), stále přetrvávají obavy týkající se rozšířeného používání antibiotik a je třeba věnovat pozornost otázkám odpovědného dozoru nad užíváním antibiotik a rezistence na antibiotika. . Je také důležité si uvědomit, že i když si jsou vědomy specifických vedlejších účinků a interakcí, mají botanické a přírodní léky obecně příznivý bezpečnostní profil ve srovnání s antibiotiky na předpis a mají širší spektrum účinku s více synergickými sloučeninami přítomnými v jedné rostlině. Použití více rostlinných léčivých přípravků v kombinaci může dále zvýšit synergii a účinnost a snížit riziko vývoje rezistence na patogeny.
Závěr
Závěrem jsme testovali panel botanických a přírodních produktů, které běžně používají pacienti s lymskou boreliózou, a zjistili jsme, že některé jsou vysoce účinné in vitro proti stacionární fázi B. burgdorferi včetně Cryptolepsis sanguinolenta, Juglans nigra, Polygonum cuspidatum, Uncaria tomentosa, Artemisia annua , Cistus creticus a Scutellaria baicalensis . Naproti tomu jsme zjistili, že Stevia rebaudiana, Andrographis paniculata , extrakt z grapefruitových semen, koloidní stříbro, monolaurin a antimikrobiální peptid LL37 měly malou nebo žádnou aktivitu proti B. burgdorferi v našem in vitro modelu .
Protože tradiční antibiotické přístupy nedokážou vyřešit všechny příznaky u podskupiny pacientů léčených na lymskou boreliózu, je třeba vyvinout nové léčebné strategie včetně identifikace antimikrobiálních látek, které jsou účinné proti přetrvávajícím mikrokoloniím B. burgdorferi . Budoucí studie jsou nutné k dalšímu vyhodnocení sedmi aktivních rostlinných léčivých přípravků identifikovaných v této studii jako látek, které mají lepší aktivitu než doxycyklin a cefuroxim proti stacionární fázi B. burgdorferi . Studie by měly být konkrétně zaměřeny na identifikaci aktivních složek každé botaniky, hodnocení synergických kombinací a potvrzení bezpečnosti a účinnosti na zvířecích modelech a následných klinických studiích.